前言

3月2日，山東大學陳子江院士團隊在知名期刊Journal of Clinical Investigation(IF：19.5)上發(fā)表了題為“TP63 gain-of-function mutations cause premature ovarian insufficiency by inducing oocyte apoptosis”的一項研究。該研究揭示TP63基因突變在POI發(fā)病中的作用及機制。陳子江院士團隊將本研究的背景、研究目的、研究方法及結論與讀者分享，為大家?guī)硪恍┛蒲袉l(fā)。

山東大學生殖醫(yī)學研究中心博士研究生黃橙紫和碩士研究生趙思敏為共同第一作者，陳子江院士和趙世斗教授為共同通訊作者。

背景與研究目的

早發(fā)性卵巢功能不全（POI）是指女性在40歲之前出現(xiàn)卵巢功能減退，嚴重影響女性生育力。半數(shù)以上的POI患者病因不明，通過遺傳學篩查明確其病因是實現(xiàn)POI早診早治的關鍵。TP63基因是p53家族的成員，其編碼的TAp63α特異性表達于原始卵泡的卵母細胞中[1]。在卵母細胞發(fā)生DNA損傷后，TAp63α激活從而啟動細胞凋亡，起到質量控制因子的功能[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)了與POI相關的TP63突變，但由于只有少數(shù)病例報道且缺乏功能研究，該基因突變對于POI疾病的貢獻度、基因型與表型的相關性及其臨床意義仍不清楚。本研究在大規(guī)模POI全外顯子組測序（WES）數(shù)據(jù)庫中篩選TP63基因突變，并進行全面系統(tǒng)的功能驗證，探討不同突變類型對表型的影響，揭示TP63基因突變在POI發(fā)病中的作用及機制。

方法

基于團隊前期構建的1030例POI-WES數(shù)據(jù)庫，對TP63基因進行突變篩查和功能分析。然后，通過Luciferase reporter assay、BN-PAGE、TUNEL等體外實驗檢測突變的致病性；其次，分別構建轉錄抑制結構域（TID）缺失（p63+/ΔTID）和點突變（p63+/R647C）小鼠，通過生育力測試、卵泡計數(shù)等觀察突變小鼠的生殖系統(tǒng)表型。同時，通過免疫熒光染色、Western blot等檢測下游凋亡通路的激活。此外，由于p63+/R647C小鼠生殖缺陷表型較輕，進一步對該小鼠卵母細胞進行第一極體排出率觀察、紡錘體形態(tài)染色、線粒體膜電位檢測等。最終，通過體外及體內實驗共同揭示TP63功能獲得性突變導致POI的作用機制。

主要結局

在11名POI患者中共發(fā)現(xiàn)9個TP63基因雜合突變，其中大部分突變集中在TAp63α的C端，為TID之前的截短突變或位于TID核心區(qū)域內的點突變（圖1A，紅色所示）。首先，對9個雜合突變進行體外功能研究，發(fā)現(xiàn)影響TID的6個突變體與N端轉錄激活結構域（TAD）的結合受損，導致突變體形成開放的激活型四聚體，從而引起下游靶基因NOXA、PUMA和BAX表達增加和細胞凋亡。其次，發(fā)現(xiàn)p63+/ΔTID雌鼠不育，p63+/R647C雌鼠生育力下降。p63+/ΔTID和p63+/R647C雌鼠均出現(xiàn)卵泡過早耗竭的POI樣表型，但p63+/R647C小鼠表型較輕。p63+/ΔTID小鼠卵泡于生后10天（P10）完全消失（圖1B），p63+/R647C小鼠卵泡P10時減少至野生型小鼠的約50%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，p63+/ΔTID和p63+/R647C小鼠卵母細胞凋亡比例顯著增加，p63+/ΔTID卵巢中凋亡基因Bax、Puma、Noxa表達增加。同時，除了在p63+/R647C小鼠中觀察到卵母細胞丟失外，其剩余存活卵母細胞的第一極體排出率降低，異常紡錘體率增高且線粒體膜電位下降，提示卵母細胞質量受損，這表明具有不同轉錄活性的不同突變類型決定了卵母細胞的耗竭速度和表型差異?？傊?，該研究表明TP63是一個比較常見的POI致病基因，對突變攜帶者的遺傳咨詢和生育指導具有重要意義。

圖1  TP63基因突變及p63+/ΔTID小鼠卵泡過早耗竭

結論

本研究明確了6個TP63基因突變導致TAp63α蛋白C端的TID功能受損，引發(fā)TAp63α蛋白從封閉的失活二聚體構象轉變?yōu)殚_放的激活型四聚體，自發(fā)激活下游凋亡相關靶基因的表達，進而誘導卵母細胞凋亡，最終導致POI（圖2）。該研究不僅揭示了功能獲得性基因突變導致POI的新機制，更為女性特別是腫瘤放化療患者的生育力保護提供了理論依據(jù)和干預靶點。

圖2  突變型TAp63α致病模式圖

參考文獻

1.Suh EK, et al. p63 protects the female germ line during meiotic arrest. Nature. 2006;444(7119):624-628.

2.Tuppi M, et al. Oocyte DNA damage quality control requires consecutive interplay of CHK2 and CK1 to activate p63. Nat Struct Mol Biol. 2018;25(3):261-269.